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段鋼，孫長平
(杰能科國際生物工程有限公司，無錫，214035)
摘要：生物質作為可以再生的能源廣泛存在于自然界中。應用酶水解技術處理生物質所制造的燃料酒精可以部分替代石油，生物質還可以被進一步轉化成其他的化學產品及生物化學品。預處理過程和纖維素酶成本的降低，纖維素酶效率的提高是生產生物質酒精及其他化學產品的關鍵。文中介紹了該轉化過程的關鍵技術及其發展進程和最新進展。
1介紹
木質纖維素原料可以用來生產酒精，是一種能替代有限的石油資源的能源。淀粉類糧食作物生產的燃料酒精已經替代部分汽油成為汽車的能源。然而與石油燃料相比較，生產成本相對較高。以玉米淀粉為基礎原料來生產酒精，由于受土地限制產量是不可能大幅度增加的。一種低成本酒精生產的潛在的原料，就是利用木質纖維原料，如農作物殘渣、草、碎木片、木屑和動物的固體排泄物等。由于生物精練廠替代了煉油廠，作為再生能源的碳水化合物的原料轉化成碳氫化合物可以更有益于社會和環境保護。以生物質為基礎的酒精生產，其轉化過程主要有2部分：木質纖維生物質中的纖維素被水解生成還原糖和用還原糖的發酵來生產酒精。當前由木質纖維原料來生產酒精存在的主要問題是水解過程中產量低，生產成本高。目前在這方面的研究已取得一些成果。首選的方法是對生物質原料進行熱的化學預處理和用酶水解，經過預處理的原料成為可轉化成酒精的發酵糖。預處理的研究是集中在縮短微生物轉化的時間，減少纖維素酶的用量和提高酒精的產率等方面。纖維素酶的研究則集中在開發高效、高熱穩定性、與其他酶混合所產生的協同增效作用來滿足終端用戶的需要。對于能將生物質糖轉化成酒精和其他生物產品的高活性的發酵微生物也正在被開發利用。相信不久的將來，會出現生物質酒精生產的投資和建工廠(圖1)。
木質纖維原料的預處理可以除去木質素和半纖維素，能夠明顯提高纖維素的水解水平；應用適合的纖維素酶也能夠提高水解水平；邊糖化邊發酵的工藝能有效地減少對于纖維素酶活性有抑制作用的葡萄糖含量，這樣就能夠提高生產量和纖維素水解的速度。
生物質的酶法水解由于具有低能耗、產品專一并符合政府的環保政策而成為將來發展的主要手段。目前的纖維素酶由于其活性和穩定性水平使得其制造成本過高而阻礙著對生物質的水解應用。開發高效活性并穩定的纖維素酶成為酶制劑研究領域的必然。
木質纖維性物質含有纖維素(38%～50%)，半纖維素(23%～32%)，多酚性木質素(15%～25%)以及其他的可以提取的成分。
2木質纖維原料生產酒精的工藝技術
雖然有大量的原料可以利用，但是在工業上將生物質轉化的最大挑戰是降低操作成本。主要是預處理過程和酶制劑的成本，以及新的更有效的酵母。
2.1木質纖維原料的預處理
預處理的目的是去除木質素和半纖維素，減少纖維素的結晶度和增加原料的多孔性。成功的預處理必須滿足以下需要：
?產生大量可被酶分解的多糖(如：打開纖維素的結構，使酶可以進行作用)；
?低固定資產投入(壓力，建筑材料)；
?低能量消耗；
?從纖維素分解的C6糖的含量高；
?從半纖維素分解的C5糖的含量高；
?木質素分解反應程度低(對用于能量及化學原料，越完整越好)；
?所使用的化學品：費用低/或者可回收；
?工藝放大容易納入整個系統。
大多數的預處理并不能完全水解木質纖維原料生物質中的所有纖維素。預處理能通過去除纖維素微纖維結構周圍的半纖維素并連同木質素的改變使纖維素的酶水解更加有效。物理法、物理2化學法、化學法和生物法等工藝已經被用于木質纖維原料的預處理。普通的預處理過程由于生物質的不同結構而比較困難。所處理木質纖維原料的成分取決于生物質的來源和所處理的類型，但是，在通常情況下，使用纖維素酶和相關的酶對于天然生物質的水解更有效。下面將簡單介紹幾種預處理工藝。
(1)物理預處理：包括機械粉碎、高溫、冷凍/解凍循環和輻射，其目的是降低生物質顆粒的大小和機械晶格。這些方法操作費用一般昂貴。
(2)生物預處理：能夠使生物質中的纖維素和木質素發生降解，但不是很有效，而且需要比較長的處理時間。
(3)化學法預處理：使用稀酸(最初利用硫酸)和蒸汽或者加壓的熱水可以水解出生物質中大量的半纖維素，從中得到的可溶性糖就能夠達到比較高的產量。熱洗滌過程，使用不同的稀酸進行預處理，包括所處理生物質固體的高溫洗滌和分離，可以防止在預處理條件下所溶解的木質素和木聚糖的再析出。木質素的再析出會引起后續處理固體的酶水解的負反應。最近已經研究出在不嚴格的條件下的稀酸水解，并可以使含量較高的木聚糖轉化成為木糖，這一轉化過程必須要經濟有效，因為在許多木質纖維原料中的木聚糖含量占全部的碳水化合物的1/3以上。另一方面，一些堿也能被用來預處理木質纖維原料，處理效果取決于原料中木質素的含量。堿預處理通常對于在可溶性多聚體中去除大量的半纖維素的同時，溶解大量的木質素更加有效。堿水解的機理被認為是由于分子間的酯鍵皂化交聯形成木聚糖，由于交聯鍵的斷裂，木質纖維原料多孔性的增加，經過稀堿NaOH處理后會引起原料的膨脹，從而導致內表面積的增加，聚合度和結晶度的降低，木質素和碳水化合物之間結構鍵分開，木質素結構被破壞。氨冷凍噴爆(AFEX)分解纖維素并能減少纖維素酶的用量，同時還能去除半纖維素和木質素。采用CO2汽爆對纖維素進行預處理的效果也很好。
(4)氧化去除木質素木質素能被過氧化物酶和過氧化氫酶所氧化而降解。用H2O2預處理會大大提高酶水解的靈敏性。在30℃，2%H2O2下處理8h，大約有50%的木質素和大部分的半纖維素被溶解，并且在隨后的糖化中，在45℃，24h之內，被纖維素酶作用的纖維素可以產生95%的葡萄糖。
(5)有機溶解過程：在有機溶解處理過程中，一種有機或水合有機溶劑混合物與無機酸(硫酸或鹽酸)催化劑一起被用來分解原料內部的木質素和半纖維素的連接鍵。有機溶劑包括甲醇、乙醇、丙酮、乙烯乙二醇、丙烯乙二醇以及四水合糠醛乙醇。有機酸如草酸、乙酰基水楊酸和水楊酸也能被用做有機溶解過程中的催化劑。高溫時(溫度超過185℃)，對于正常的去除木質素作用的過程中不必加入催化劑，加入酸能夠得到較高的木糖產量。為了降低生產成本和保護環境，必須將在預處理過程中所使用的溶劑加以回收利用，另外將溶劑從生產系統中去除也是必需的，因為有機溶劑可能會抑制微生物的生長繁殖，影響酶水解和發酵。
(6)微生物預處理：在微生物的預處理過程中，一些微生物例如褐色、白色和溫和的腐敗真菌可以被用來降解廢物原料中的木質素和半纖維素。白色腐敗真菌對于木質纖維原料的微生物預處理效果最好，許多白色腐敗真菌產生的細胞外酶能夠降解木材細胞壁。其他的酶包括多酚氧化酶、漆酶、過氧化氫生成酶和苯醌還原酶也能降解木質素。微生物預處理的優點有低能耗和溫和的作用條件。然而，大多數的微生物預處理過程中的水解速度很慢。
所有的預處理工藝都會受到密集投資的制約。例如，對于水解過程所需要的昂貴的反應器材料以及由于在預處理過程中所使用的催化劑而生產的廢物的處理和回收的成本。一些預處理工藝，像AFEX，由于廢物產生得較少，優勢比較明顯，這樣，在預處理中可以實現比較高的纖維素的消化利用，高的半纖維素糖的回收，較低的資金投入和低的木質素分解以及降低生產過程中化學品的回收利用成本。
2.2酶水解
纖維素的酶水解是由具有高效性的纖維素酶來完成的。水解產物通常是包含葡萄糖在內的還原糖。同酸或者堿相比較，酶水解的成本是比較低的，因為酶通常是在比較溫和的條件下(pH值4.8，溫度45～50℃)完成，而且不會有腐蝕問題。細菌和真菌能產生使木質纖維原料水解的纖維素酶。微生物可以是需氧或厭氧的、嗜熱或嗜溫的。纖維素酶通常是幾種酶的混合物，在水解過程中包括至少3種主要的纖維素酶：
(1)內β-葡聚糖酶(EG內切21，42D2葡聚糖苷水解酶，或EC3.3.1.4)，主要用在纖維素中低結晶度的區域，隨機產生短鏈分子；
(2)外β-葡聚糖酶或纖維二糖酶(CBH1，42β2D2葡聚糖，纖維二糖水解酶，或EC3.2.1.91)，進一步從隨機的短碳鏈中降解分子以去除纖維二糖。
(3)β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)可水解纖維二糖成葡萄糖。
除了這3種主要的纖維素酶以外，還有很多的輔酶能夠作用于半纖維素。如葡糖苷酸酶、乙酰酶、木聚糖酶、β2木聚糖酶、半乳甘露聚糖酶和葡甘露聚糖酶等。在酶水解期間，纖維素被纖維素酶降解成為能被酵母或細菌發酵成酒精的還原糖。
用纖維素酶水解生物質中的纖維素生產酒精有著巨大的潛力。雖然對于纖維素酶的開發已經過了數十年，但這些酶的成本還是很高。目前需要降低生產纖維素酶的成本才能使木質纖維生物質生產酒精的工藝更具有競爭性。纖維素酶是作用相對緩慢的酶，實質上是由于它們所作用底物的復雜的，不可溶解的，和半晶體的結構。除此以外，還需要纖維素酶有比較高的活力以及相關的內β-葡聚糖酶，外β-葡聚糖酶和β2葡萄糖苷酶的協同作用才能將纖維素完全轉化成葡萄糖。
用纖維素酶生產生物酒精，在酶的開發方面，不僅要提高酶的穩定性，而且還要在預處理工藝的苛刻的條件下提高酶的有效的活性。其次，不同的生物質，其預處理工藝都是不一樣的，結果也會使產物含有不同的成分。因此，纖維素酶能夠分解的是預處理后的適合于酶作用的組分。例如，由于底物表面的β-1，4糖苷鍵的高通透性可以提高內、外-β-葡聚糖酶作用的效率，同時外-β-葡聚糖酶與內-β-葡聚糖酶的比率較高適合于作用具有較低聚合度的底物分子。高含量的木質素阻礙酶的滲透，吸附酶使之不能作用，引起最終產物的抑制并降低纖維素的轉化率。除了纖維素的晶格和聚合度的范圍以外，半纖維素的脫乙酰作用和水解也影響酶的需求。
高含量的木質素能夠阻礙酶的滲透，吸附酶使之不能作用，引起最終產物的抑制并降低纖維素的轉化率。除了木質素以外，纖維二糖和葡萄糖也是比較強的纖維素酶抑制劑，纖維素酶的活性能夠被它們所抑制，現在已經研究出幾種方法來降低抑制作用，包括使用高濃度的酶制劑；在水解期間β-葡萄糖苷酶的補加；用超濾技術去除葡萄糖或者同時進行糖化和發酵(SSF)等方式。
SSF工藝已經被廣泛地應用于規模生產。為了減小水解最終產物的抑制作用，在這個工藝過程中，纖維素在糖化水解中產生的還原糖被立即發酵成酒精，這樣可以大大降低水解產物葡萄糖的抑制作用。
與兩段式間歇的水解和發酵工藝相比較，SSF具有以下優點：由于對纖維素酶活性有抑制作用的葡萄糖被轉化，從而可以提高水解的效率；比較少量的酶需求；比較高的產品產量；由于葡萄糖可以被立即去除并有乙醇產生，因此對于操作條件的要求比較低；比較短的生產時間；由于水解和發酵可以在一個反應器內同時進行，因此可以有比較小的反應器體積。但是，在SSF工藝中產生的乙醇也能抑制纖維素酶的活性。曾經有實驗證明，在SSF工藝的反應期間，在38℃下，當乙醇的濃度分別達到9、35和60g/L時，纖維素酶的活力會損失到它的初始酶活力的9%、36%和64%。SSF工藝的缺點有：水解和發酵溫度的矛盾；微生物對于乙醇濃度的耐受性；纖維素酶的活性被乙醇所抑制。
3纖維素酶的最新進展
目前對于發展酒精生產用纖維素酶的研究主要集中在以下幾方面：
?發現和克隆從自然界來源的酶；
?通過分子演化和設計來提高酶的功能性；
?通過強化的低成本發酵來生產酶制劑。
運用科學的研究方法，例如從已知的不同種類的纖維素酶的基因進行表達和純化；發現新酶的活性，通過基因工程和蛋白質工程識別新的纖維素酶蛋白質；在先進的工藝條件下通過蛋白質工程和直接的轉化來提高纖維素酶的性能，使酶獲得改進；并尋找使最大量的生物質混合物降解的最優化方案。這些研究成果最終導致發現了幾種新型的糖基水解酶。而且，以前很多的未知的里氏木霉(T.reesei)蛋白質的基因密碼也被發現，例如：葡聚糖酶，殼多糖酶，蛋白酶等等。
杰能科國際生物公司與美國能源部開展合作，研制開發從木質纖維原料中轉化酒精的生物技術，已經取得了突破性的成就。從2000年起，杰能科國際生物公司與美國能源部下屬的美國國家再生能源實驗室(NREL)合作，雙方共投資2000萬美元，開發低成本的纖維素酶和其他的酶，用來轉化生物質生產酒精和其他產品。在NREL模式下，3年內的目標是將纖維素酶的成本降低1/10倍。這一目標已在在以下2個方面取得了重大的進步：①纖維素酶生產的經濟性(每克酶減少的成本)和②纖維素酶的性能(所需纖維素酶減少的克數)。2003年，由于研究開發了一套生產強效的纖維素復合酶系統的工藝，酶的成本降低20倍的目標，而且還超過了此目標。最近，酶的成本又進一步降低至原來的30倍，因此酶制劑的成本問題已經不再是工業化的主要阻礙。當然值得指出的是，這個酶成本的降低是以美國能源部所提供的預處理底物為基準的，對其他底物的處理效果可能會不同。
4生物質生產酒精前景展望
利用木質纖維生物質生產燃料酒精可以改善能源保障，實現能源供應的可持續發展，同時拉動農業及其他相關行業的經濟發展。盡管生物質酒精的生產通過技術改進已經有了很大的發展，但仍面臨著許多挑戰：
——開發性價比更好的纖維素酶；
——在商業范疇內，開發基因工程酵母；
——研究更高效的預處理技術；
——摸索整個乙醇生產系統中最優的經濟成分配置。
除了前面提到的酶制劑成本及有效性外，工業化面臨的另一個難題是，在預處理過程中產生的5C糖并不能被目前在工業上廣泛應用的Saccharomyces酵母所利用。美國能源部與杜邦化學、美國玉米種植協會合作以期找到可有效利用木糖、戊糖和阿拉伯糖的菌種，該計劃預計在2007年之前完成。
更有效和環保的預處理過程和過程的優化對工業化業有非常大的影響。當然，如前面提到的，系統過程的放大，工程的設計優化還需要時間。然而隨著科學技術的飛速發展，能源危機的加重，相信在不遠的將來，以酶解技術處理生物質將被應用于工業化酒精和其他生物產品的生產上。 |
